이 문서에서는 RPPA 역방향 단백질 마이크로어레이 기술 (비바이오메트릭 제공), 스펙트럼 기술, 항원/항체 어레이 기술, 적절한 배우자에 기반한 감지 기술, 직교 확장 기술 (PEA) 등 액체 생검 샘플에서 최소 수백 가지의 단백질을 감지할 수 있는 고함량 프로테오믹스 기술 (그림 1) 의 원리를 간략하게 설명합니다.
Proteomics 에서 액체 생검 바이오 마커의 연구 배경
종양 진단의' 금기준' 조직 생체검사에 비해 액체 생체검사는 최소 침습 방법으로 테스트 샘플을 얻어 이질성을 극복하고 동적 모니터링을 할 수 있다. 현재 액체 생체검사에 사용되는 체액은 주로 혈액과 소변이지만, 이론적으로 액체 생체검사는 모든 인체 내 순환이나 기타 인체 관련 액체에 적용된다 (그림 2). 대부분의 세포 기능의 직접 집행자와 대부분의 암 치료에서 직접 약물 표적으로, 다단백체학 데이터의 분석은 암 진행의 모든 단계에서 실시간으로 더 가치 있는 임상 정보를 제공할 수 있다. 액체 생체검사 샘플의 단백질은 단백질 풍도의 지속적인 빠른 변화와 번역 후 손질과 같은 큰 복잡성을 가지고 있다. 동시에, proteomics 기술은 여전히 매우 복잡 한 시퀀싱 기술에 비해 몇 가지 한계가 있다, proteomics 의 탐사는 여전히 게놈 기술 뒤에, 임상 변환 효율성이 매우 낮은, 현재 40 개 이상의 액체 생 검을 기반으로 proteomics 바이오 마커. 따라서 암 액체 생체검사에서 바이오마커를 찾는 목표를 달성하기 위해서는 새로운 단백질 기술이 절실히 필요하다.
다양한 기술의 비교
I. 질량 분석
체액 샘플에서 단백질의 복잡성으로 인해 현대 스펙트럼 기술은 샘플 준비 방법을 지속적으로 최적화하고, 단백질 정량 기술을 개발하고, 스펙트럼 스캔 패턴을 변경하여 검출 정확도를 높인다. 스펙트럼은 가설 구동 없이 샘플 속의 단백질을 공평하게 스캔할 수 있기 때문에 암체액 샘플의 초기 바이오 표지물 발견에 선호되는 방법으로 사용할 수 있다. 현재 스펙트럼 기반 바이오마커 전략은 주로 (1) 발견, 검증, 검증 3 단계에서 샘플 수가 점차 증가하고 단백질 범위가 점차 줄어드는' 삼각 전략' 입니다. (2) 발견과 검증 단계에서 새총법을 이용하여 큰 샘플 대기열에서 가능한 많은 단백질을 검출한다. 평행 분석에 따르면 뚜렷한 차이가 있는 단백질은 준생물표지물의' 직사각형 전략' 으로 사용될 수 있다. 현재, 스펙트럼 기반 액체 생체검사는 난소암, 비뇨기계 암, 결장암 등 암에 적용되었다. 그러나 스펙트럼 기술이 임상 실험에 광범위하게 적용되려면 검사 과정을 단순화하고 규범화하고, 검사 플럭스, 정확성, 노봉성을 높이고, 번역 후 손질단백질의 검출 한계를 돌파해야 한다.
둘째, 항원/항체 어레이 기술
항체 배열은 형광, 화학 발광 또는 올리고 뉴클레오티드 마커를 통해 수정 된 평면 기판에 특이항체 고정을 통해 여러 타겟 (보통 수백 개) 샘플을 감지하는 방법입니다. 종양과 관련된 저풍도 분비단백질의 검출과 같은 혈청학 분석에 적용된다. 그러나, 검출 플럭스, 검출 동적 범위, 배치 효과, 신호 포화도 및 정량적 정확도의 제한으로 인해 항체 배열은 체액 기반 프로테옴 분석 방법 중 하나로만 사용될 수 있습니다. 항원 배열은 기능성 단백질 배열이라고도 하며 항원 검사 플랫폼으로 항체 구성의 미묘한 변화를 감지할 수 있다. 그 초기 인기 응용은 혈청 자체 항체 연구를 통해 바이오 마커 (AAB) 를 연구하는 것이었다. 가장 포괄적인 인간 항원 어레이는 8 1% 이상의 단백질을 포괄하며 혈액 단백질의 파노라마 분석을 위한 강력한 도구이다. 그러나 항원 어레이의 목표 확장성, 반복성, 배치 효과 및 고비용은 여전히 그 응용을 제한하고 있습니다.
셋째, aptamer 기반 테스트
SOMAscan 은 고통에서 새로 개발한 정량 프로테옴 검사 도구로, 천천히 손질된 단백질체를 기반으로 다른 단백질과 밀접하게 결합될 수 있다. SOMAmer 는 광분해 커넥터 또는 형광 마크와 결합된 올리고 뉴클레오티드 리간드입니다. 구상인식과 바이오틴 매개순화 후 자외선을 통해 세제체 단백질을 비추고 반응 샘플에서의 단백질 풍도를 표상하고 정량한다. 이 방법은 매우 높은 특이성과 친화력을 가지고 있어 배치 간의 차이가 적다. 현재 7000+ 단백질의 종류를 병렬적으로 분석해 직장암과 비소세포 폐암 임상 관련 바이오마커를 선별하는 데 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 현재 단계에서 연구할 수 있는 핵산 적응체의 종류는 항체 검사에 비해 제한적이며, 특히 번역 후 변형 단백질을 지향하는 핵산 어댑터 개발은 아직 초기 단계에 있다. 한편, 핵산 적정체가 항원 결정클러스터에 대한 높은 친화력으로 인해 대량의 신호가 단백질 표지물의 연구를 방해하여 검사의 정확성에 영향을 미칠 수 있다.
넷째, 인접 확장 기술 (PEA)
PEA 는 항체 기반 면역측정 (ELISA) 과 PCR 또는 2 세대 시퀀싱 (NGS) 기술을 결합했다. PEA 는 질량 분석법에 비해 낮은 샘플 양으로 더 넓은 동적 범위를 감지할 수 있으며 고감도, 정확성, 반복 가능성 및 충실도를 제공합니다. 현재 가장 선진적인 PEA 탐지는 Olink Corporation 이 상용화하여 3072 개 목표에 대한 표준 측정을 할 수 있다. PEA 는 먼저 결장직장암의 혈액 예후 표시를 확인한 다음 난소암, 전립선암 및 기타 암 종류에 대한 조기 검사, 동반 진단 및 질병 모니터링에 사용됩니다. PEA 탐지는 판독 방법 (qPCR, NGS) 과 관련이 있으며, 큰 대기열 샘플을 분석할 때는 여전히 실험 오차와 배치 효과를 고려해야 합니다. 둘째, 번역 후 단백질 손질에 대한 연구는 항체 발전에 큰 병목 현상이 있어 캡처가 어느 정도 제한된다.
동사 (verb 의 약어) 역방향 단백질 마이크로어레이 기술 (RPPA)
RPPA 는 20 년 전에 시작되었습니다. 완전히 변성 된 단백질 용해 생성물을 특수 슬라이드에 고정시킵니다. 일반적으로 각 용해 생성물은 농도 구배에 의해 희석된다. 그런 다음 점 모양의 슬라이드가 고도로 특이적인 항체 (그림 3) 와 함께 부화하고 정량 정보는 신호 확대 화학 발색 또는 형광 감지를 통해 캡처됩니다. RPPA 는 수백 개에서 1000 개 이상의 대형 샘플에 대한 매우 안정적인 병렬 분석에 광범위하게 사용될 수 있으며 정량적으로 정확합니다. 500+ 종의 세포 표면 수용체 단백질, 세포 신호의 핵심 단백질 및 단백질 변형 (인산화, 아세틸화, 메틸화 등) 을 체계적으로 감지할 수 있다. ), 프로테아제, 전사 인자 등 대표적인 표적으로, 직접 및 간접 상류 단백질 네트워크 분석을 포함한다. 이러한 기능을 바탕으로 RPPA 는 공개 데이터 세트 (TCPA, http://tcpaportal.org) 를 온라인으로 사용할 수 있는 암 게놈 매핑 프로젝트 (TCGA) 에 널리 사용되고 있습니다. 최소한의 배치 차이로 인해 RPPA 는 단백질의 바이오마커 검증을 위한 강력한 도구로 사용할 수 있으며 폐암의 새로운 바이오 마커 검증에 성공적으로 적용되었습니다. 또한, 외분비체 단백질의 검출은 이미 암 액체 생체검사에서 RPPA 의 또 다른 핫스팟 응용이 되었다. 비생물은 국내에서 MD Anderson 골드 표준에 기반한 RPPA 분석 기술 플랫폼을 구축하여 일련의 워크플로우 개발, 검증 및 최적화, 항체 라이브러리 확장, 완벽한 원시 정보 분석 시스템 구축을 앞당겼습니다. 국내 과학 연구, 임상자 및 약물 개발 관련 사용자가 질병, 특히 종양 관련 신호 경로 파노라마 분석, 분자 메커니즘 발굴, 종양 관련 약리 연구 및 표적 약물 개발을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있도록 지원합니다. RPPA 의 복잡한 기술 프로세스와 엄격한 항체 심사 프로세스는 더 이상 국내 연구원들의 기초 및 전환의학 연구에 걸림돌이 될 수 없습니다. (자세한 내용은 아래의 "원문 읽기" 를 클릭하십시오.)
전망
앞으로, proteomics 기술의 지속적인 발전을 전제로, 각 기술의 공동 보완 응용은 종양 체액 생검을 기반으로 한 바이오 마커의 실행 가능한 직교 검증 전략 (그림 4) 으로 사용될 수 있습니다. 비생물 유기체는 RPPA 기술 등 각종 게놈학 신기술에 의지하여 종양 정밀 치료 연구와 핵심 사명으로 전환된다. 우리는 더 간결하지만 일관성 있고 표준적인 단백질 바이오 마커 개발 과정을 기대하고 있으며, 결국 암 전환의학 연구에 적용될 것이다.