키워드: 점 돌연변이; 중합 효소 유전성 지중해 빈혈; 유전자 돌연변이 검진
중국 도서관 분류 번호: Q3 19.3 1 문서 id: a 문자:1007-7847 (2007) 04-0295
베타 지중해 빈혈 (베타 지빈증) 은 상염색체 열성 유전병으로, 베타 글로빈 유전자의 돌연변이나 부족으로 인해 글로빈 HBA (알파 2β 2) 의 펩타이드 사슬 합성이 감소하거나 합성되지 않아 α와 베타 사슬 합성이 불균형하게 된다. 태아가 부모의 베타 지중해빈혈 유전자 두 개를 동시에 받으면 돌연변이 순합자를 위해 대부분 심한 베타 지중해빈혈로 나타난다. 현재 효과적인 치료법은 없다. 이 환자들은 종종 젊은 나이에 사망하거나 수혈로 유지된다.
점 돌연변이는 β-thalassemia 유전자 중 가장 흔한 돌연변이이다. 베타-글로빈 유전자 CDl7(A→T) 점 돌연변이는 베타-지중해 빈혈과 관련된 가장 먼저 보도된 점 돌연변이 중 하나이다. 전통적인 베타-지중해빈혈 유전자 돌연변이 검출 방법은 젤 전기 영동에 기반을 두고 있다. 수술은 복잡하고 시간이 많이 걸린다. 현재 일반적으로 사용되는 진단 방법은 중합 효소 사슬 반응이 반점 교배와 결합되어 정확도가 높지만 방사성 동위원소 표시와 번거로운 분자 교배 기술이 필요하다. Pun 등은 방사성 동위원소 표기가 필요하지 않은 새로운 트랜스젠더 고효율 액조색 유전자형 기술을 보도했다. 하지만 이 방법은 조작이 복잡하고, 기기가 비싸며, 실험주기가 길다. 새로 개발된 실시간 형광 PCR 기술은 유전성 혈색병에서 HFE 유전자의 점 돌연변이를 탐지하는 데 사용되었지만, 프로브의 설계 난이도와 테스트 기기의 고비용이 널리 활용되고 있다.
이중 체인 결합 염료가 이중 체인 DNA 에 내장되어 형광을 방출하는 원리를 바탕으로 실온에서 중합 효소 활성을 실시간으로 검출하는 간단한 방법을 세웠다. 이를 바탕으로 폴리효소 확장 기술과 쌍사슬 특이성 임베디드 염료의 특성을 바탕으로 빠르고 간편한 점 돌연변이 실시간 탐지 방법을 개발해 염료를 내장하고 형광 신호를 변경함으로써 점 돌연변이 탐지를 가능하게 했다. 값비싼 기기는 필요 없다. 조작은 쉽고 간단하며 복잡한 젤 전기 수영 조작과 마크가 필요하지 않습니다. 이 방법을 이용하여 지중해 빈혈병 관련 유전자 CD 17 의 돌연변이를 검출하여 유전자 점 돌연변이와 단일 뉴클레오티드 다형성 탐지를 위한 빠르고 간편하며 효과적인 방법을 제공하며 약물 선별, 질병 예방 및 단체 계획을 위한 새로운 수단과 사고를 제공한다.
1 실험
1..1시약 및 기기
시약: 유인물과 과뉴클레오티드는 대련보생물회사 (Takara) 가 합성해 표 1 을 순서대로 본다. Klenow Fragment(exo-) 중합 효소 (KF- 효소, Fermentas), SYBR Green Tris (상하이 과학기술개발유한회사), TakaRa Ex Taq 효소 (TakaRa), 그리고 기기는 미국 Perkin Elmer LS-55 형광 분광 광도계, 미국 Amersham 항온수욕, ABI 회사 Ce-neAmPTM PCR System 2700 입니다.
1.2 실험 방법
1.2 1 형광 측정
본 연구에서는 쌍체인 특이성 결합 염료 SYBRGreen I 를 사용하여 497 nm 광으로 형광 강도를 측정하고 520nm 에서 검사했다. 기기의 입사 슬릿과 발사 슬릿은 모두 2.5nm 으로 설정되고 형광값이 안정된 후 샘플은 37 C 온도 65438±00min 에서 측정되며 샘플 용액의 최종 부피는 200 μ l 입니다 .....
1.2.2 점 돌연변이 검출
기본 용액 준비 1 (프라이머 N3 100 nmol/L, 50MMMOL/L LTR IS-HCL (PH 8.0), 5mmol/L MgCl2 N 1 및 최종 농도가 100 nmol/L 인 N2 를 추가하면 1mmo|/L DTF, 50μmol/L dNTP 혼합물 (동일 비율 형광강도가 안정되면 2.5U KF 효소를 넣고 형광강도의 변화를 지속적으로 감시한다.
1.2.3 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동
전통적인 전기 수영 방법으로 점 돌연변이의 검사 결과를 검증하다. 샘플 용액 A, B, C 는 95 C 에서 5 분 동안 변성한 다음 0 C 에서 5 초 동안 담금질해 7% 우레아와 은염색이 함유된 20% 폴리아크릴 젤전기 영동으로 분석한다.
1.2.4 온도가 검출에 미치는 영향
각각 25 C, 30 C, 34 C, 37 C, 42 C, 47 C 에서 샘플 용액 A 에 2.5U KF 효소를 넣어 형광 강도의 변화를 감시한다. 1000s 중합 형광 신호 값의 비율 (S/B) 을 검출 기준으로 온도가 검출 시스템에 미치는 영향을 조사했다.
1.2.5 금속 이온이 검출에 미치는 영향
네 가지 금속 이온 (M2+, Ca2+, K+ 및 Na+) 이 중합 효소 중합에 미치는 영향을 연구하고 샘플 용액 A 에서 염화 마그네슘의 농도를 조절하여 Mg2+ 의 영향을 연구했다. 샘플 A 에 CaCl2 _ 2, KCI, NaCl 용액을 넣어 다른 농도로 조절하고 참고 문헌 [1 1] 의 초기 반응 속도를 계산하여 이온이 수렴반응에 미치는 영향을 조사합니다.
1.2.6 지중해 빈혈 유전병 점 돌연변이 샘플의 제비 및 검사
우리는 지중해 빈혈 유전병에서 CDl7(A→T) 점 돌연변이를 발견했다. 샘플 10 부 (남방의과대학의학유전학실 순합자 3 부, 잡합자 3 부, 본 연구실 정상 샘플 4 부). 표준 DNA 추출 기술에 따라 환자와 정상인의 백혈구에서 샘플의 전체 게놈 DNA 를 추출하고, 프라이머 (표 65,438+0) 는 프라이머 5 를 따른다. PCR 시스템 (50ngL) 에는 0.5U TakaRa Extaq 효소, 0.2mmol/L dNTP 혼합물, 1×PCR 버퍼, 800nmol/L N6,/kloc 가 포함됩니다 PCR 반응 절차는 다음과 같습니다: 94 C 변성 5min, 그리고 94 C 변성. 57 C 어닐링 35s, 72 C 확장 30s, 순환 40 회. PCR 제품은 표준 겔 전기 영동에 의해 정제되어 ODA 를 검출했다. 기본 용액 3( 100 mmol/L 프라이머 n5,50mmol/l tris-HCl (ph 8.0), 5mmol/L MgCl2,/kloc-0
2 결과 및 토론
2. 1 실험 원리
실험 원리는 그림 1 과 같습니다. 특이성 등 유전자 유인물을 설계하는데, 그 3' 끝은 템플릿의 돌연변이 (다태성) 염기점에서 끝난다. 템플릿과 프라이머가 정확히 일치하면 프라이머는 중합 효소의 작용으로 이중 체인을 형성하고, 이중 체인 특이 염료는 신생의 이중 체인 영역에 삽입되어 형광 강도가 향상됩니다. 그러나 템플릿과 프라이머가 3' 끝에서 일치하지 않으면 프라이머가 효과적으로 확장되지 않고 형광 신호가 변경되지 않습니다. 형광 신호의 변화를 관찰함으로써. 점 돌연변이 탐지를 실현하다.
2.2 점 돌연변이 검출 방법
문헌 [13 ~ 15] 에 따르면 지중해빈혈 유전병 CD 17 의 점 돌연변이 과녁 시퀀스 (표 1) 를 합성한 과뉴클레오티드로 시뮬레이션했습니다. 50% 의 N 1/N2 혼합 샘플 모의 잡합 유전자형. 그림 2 는 특이성 등 유전자 유인물을 이용한 점 돌연변이 검사 결과를 보여준다. 유인물 N3 의 3' 끝은 돌연변이 염기점에서 끝나며 N 1 의 순합자와 정확히 일치한다. 중합효소의 작용으로 보완적인 dNTP 는 유인물의 3'-OH 끝에 하나씩 더해져 쌍사슬 구조를 형성하고 염료 SYBR Green I 는 쌍사슬에 묻혀 형광을 만들어 낸다. 템플릿이 N2 순합일 때 프라이머 N3 의 3' 끝이 일치하지 않기 때문에 수렴 확장 반응이 효과적으로 발생하지 않으며 형광 신호가 크게 증가하지 않습니다 (곡선 3). 템플릿이 뒤섞이면 형광 신호도 크게 향상되지만 (곡선 2) 형광 증가율은 곡선 1 보다 현저히 낮습니다. 형광의 변화를 통해 세 가지 유전자형을 효과적으로 구분할 수 있다. 더 나은 검사점 돌연변이를 위해 N2 순접합자와 정확히 일치하는 프라이머 N4 를 사용하여 감지했습니다. 템플릿이 N 1 일 때 중합 효소를 넣는다. 프라이머 N4 의 3 으로 인해 템플릿이 N2 일 때 DNA 중합 효소가 추가됨에 따라 형광 신호가 빠르게 증가하고, 템플릿이 뒤섞이면 형광도 향상되지만 정확히 일치하는 템플릿 N2 보다 성장이 적습니다. 이 테스트 결과는 N3 프라이머를 사용할 때와 동일합니다 (그림에 표시되지 않음).
2.3 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동
우리는 기존의 트랜스젠더 폴리아크릴 젤전기 영동을 이용하여 점 돌연변이 검사 결과를 검증했다. 그림 3 에서 1 ~ 3 도는 각각 N 1, N2 및 N3 의 밴드입니다. 레인 4 ~ 6 은 각각 샘플 용액 A ~ C 의 반응 샘플 용액입니다. 우리는 레인 4 (샘플 용액 A) 에서 유인물 N 1 띠가 사라진 것을 발견했다. 왜냐하면 유인물 N 1 은 수렴용 템플릿으로 사용되었지만 템플릿 N 1 스트립 위에 수렴산물 띠 (인용) 가 나타났기 때문이다. 레인 5 (샘플 용액 B) 는 효과적인 중합반응을 생성할 수 없고, 템플릿 N2 와 프라이머 N3 밴드는 계속 존재한다. 레인 6 은 샘플 용액 C 의 반응액으로, 인포밴드, 템플릿, 중합생성물대를 볼 수 있지만, 수렴생성물대는 레인 4 보다 밝기가 약하여 수렴생성물이 레인 4 보다 적다는 것을 알 수 있다. 위의 전기 수영 결과는 형광 실험 결과와 일치하여 형광 분석 방법이 믿을 만하고 정확한 유전자형 방법임을 보여준다.
2.4 온도가 검출에 미치는 영향
항온수욕을 조절하여 온도를 각각 25 C, 30 C, 34 C, 37 C, 42 C, 47 C 로 조절하고 샘플 용액 A 에 중합효소를 넣어 형광강도의 변화를 감시한다. 결과는 그림 4 와 같습니다. 그림 4 에서 볼 수 있듯이 온도가 높아지면 폴리효소가 없을 때 형광 신호와 형광 배경의 비율 (S/B) 이 증가하지만 온도가 37 C 를 초과하면 S/B 가 증가한다.
2.5 금속 이온이 검출에 미치는 영향
점 돌연변이 검출은 중합 효소 확장 반응에 기초한다. 중합 효소의 중합 효율은 이 방법의 신호 생성과 감도에 중요한 영향을 미친다. 우리는 몇 가지 중요한 금속 이온 (Mg2+, Ca2+, K+, Na+) 이 중합반응에 미치는 영향을 연구했다 (그림 5). 그림에서 볼 수 있듯이, M 이 없을 때, 중합 반응이 일어나지 않고, Mg2+ 농도가 증가함에 따라 초기 반응 속도가 빨라진다. Mg2+ 농도가 10 ~ 15 mmol/L 에 도달하면 초기 반응 속도가 가장 빠르며 농도가 계속 증가하면 중합 효소의 활성이 어느 정도 억제됩니다. 이는 Mg2+ 가 반응에서 중합 효소의 활성화제로 사용된다는 것을 의미합니다. 그러나 Ca2+ 농도가 30 mmol/L 보다 크면 저농도 Ca2+ (20MMMOL/L 미만) 는 중합 효소 활성에 거의 영향을 주지 않습니다. 반응 속도에 뚜렷한 억제 효과가 있습니다. K+ 와 Na+ 의 존재는 중합 효소의 활성을 억제하고 농도가 증가함에 따라 중합 효소의 활성을 억제한다. K+ 와 Na+ 농도가 100mmol/L 보다 높으면 중합 반응이 기본적으로 억제됩니다.
2.6 thalassemia 질병 점 돌연변이의 유전자형
지중해 빈혈은 유전성 혈액병이다. CDl7 점 돌연변이 유형을 감지했습니다. 결과는 그림 6 과 같습니다. 그림에서 볼 수 있듯이, 중합효소를 넣지 않을 때 세 가지 유전자형의 형광신호는 비슷하지만, 중합효소를 첨가한 후 세 가지 유전자형 간에 뚜렷한 차이가 있으며, 중합효소를 첨가한 후 돌연변이 순합자가 완전히 일치하는 프라이머 (N5) 의 형광신호가 급격히 증가한다 (곡선 1). 야생형 순합자가 중합효소를 첨가한 후 형광 신호는 크게 변하지 않았다 (곡선 3). 그러나 중합 효소에 잡합자를 넣으면 형광 신호도 크게 향상된다. 그러나 형광은 돌연변이 순접합체 (곡선 2) 보다 현저히 낮았다. 염료 분자를 첨가하여 형광 신호를 관찰하면 CDl7(A→T) 의 점 돌연변이를 쉽고 빠르고 정확하게 식별할 수 있다.
3 결론
폴리효소 확장 기술을 바탕으로 쌍사슬 이성 형광염료의 임베딩을 통해 형광신호의 변화에 따라 점 돌연변이의 유전자형 결과를 직접 제시한다. 이 방법은 방사성 동위원소 표시나 유인물과 과뉴클레오티드의 형광 표시를 필요로 하지 않는다. 저렴한 비용 실험조작은 간단하고, 젤 전기 수영 검출과 복잡하고 비싼 기기를 필요로 하지 않고, 점 돌연변이로 인한 유전병의 예방과 검진을 위한 간단하고 빠른 방법을 제공하며, 단일 뉴클레오티드 다형성의 단체 계획에 대한 새로운 아이디어를 제공한다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 건강명언)
저자 소개: 맹호현 (1972-) 여성, 호남화용인, 호남대 부교수, 박사, 분자수준의 생물분석화학연구에 종사한다. 왕크민 (1957-), 남자, 호남원강인, 교수, 박사, 통신원, 나노 및 분자수준의 생물분석화학 및 나노 생명공학 연구에 종사하고 있습니다.