해당 제 1 항체 특이성과 결합한 다음 효소 또는 동위원소 마크의 제 2 항체 결합으로, 마지막으로 기질 발색이나 방사자현상기를 통해 특정 목적의 유전자 발현을 검출하는 단백질 성분을 검출한다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 과학명언)
단백질 샘플 준비
원시 샘플은 세포, 조직, 배양상청액, 면역침전 또는 친화순화된 단백질이 될 수 있다. 다음은 목적단백질의 질적 검사를 위한 세포 샘플 처리 방법이고, 나머지 샘플 준비 방법은 관련 문헌을 참고한다.
1. 세포 또는 약물 치료를 배양합니다.
2. 배양기를 버리고 1X PBS 로 세포를 두 번 씻어서 남아 있는 배양기를 제거한다.
3. 1X SDS 샘플 완충액을 추가하여 세포를 긁어내고 Ep 관으로 옮깁니다. 참고: 얼음 위에서 조작합니다.
4. 초음파 절단 DNA 10 ~ 15 초 샘플 점도를 낮춥니다.
5. 샘플을 5 분간 끓인다.
6. 원심 분리 12000g 5min, 청액 제거.
Sds-페이지 전기 영동
먼저 유리판을 청소하세요
둘째, 접착제와 샘플
1. 유리판이 정렬된 후 고정장치에 넣어 클램프합니다. 그런 다음 선반에 수직으로 붙여 접착제를 붓는다.
2. 10% 분리 접착제와 혼합하고, TEMED 를 추가하고, 접착제를 붓기 전에 바로 흔들어줍니다. 접착제를 부칠 때 10ml 총을 사용하여 5ml 접착제를 흡입하고, 접착제가 녹색대 중앙선 높이로 올라갈 때까지 유리를 따라 방출합니다. 그런 다음 접착제에 물 한 층을 넣으면 액체가 봉된 후 젤이 더 빨라진다.
3. 물과 접착제 사이에 굴절선이 있을 때 접착제가 이미 굳었다는 것을 나타낸다. 3 분 동안 풀이 완전히 굳으면 접착제 윗층의 물을 붓고 흡수지로 말릴 수 있다.
4. 4% 의 농축액을 혼합하고, TEMED 를 넣고 바로 흔들면 접착제를 붓는다. 농축 접착제로 남은 공간을 채운 다음 빗을 농축 접착제에 넣는다. 농축 접착제가 굳으면 양손으로 빗의 양쪽을 잡고 가볍게 수직으로 위로 당깁니다.
농축 젤을 물로 헹구고 전기 영동 탱크에 넣으십시오.
6. 전기영동의 상하 슬롯에 1×Tris- 글리신 또는 SDS 전기 영동 완충액을 넣어 상형한다.
7. 전기 영동 탱크를 전기 영동 장비에 연결하십시오. 상단 슬롯은 음의 전극에 연결되고 하단 슬롯은 양수 전극에 연결됩니다. 시동 전압 70 ~ 80 V, 10min 후 100V, 전기 영동 2 시간 또는 브롬페놀 블루가 바닥에서 1cm 으로 마이그레이션될 때 전기 영동을 중지합니다.
필름을 돌리다
1. 접착제를 전이 완충액에 담그고 10 분 동안 균형을 잡는다. 참고: 소분자 단백질이 검출된다면 이 단계는 생략할 수 있다. 소분자 단백질이 젤로 쉽게 퍼지기 때문이다.
2. 접착제 크기에 따라 필름 6 개와 여과지를 잘라서 전송 버퍼액에 넣어 10 분 균형을 잡는다. PVDF 막을 사용한다면 순수 메탄올로 3-5 초 포화해야 한다.
3. 조립이동메자닌: 스펀지 3 층 필터막, 3 층 필터지 스펀지. 각 층을 다 놓은 후 시험관으로 기포를 쫓는다. 기억하십시오: 접착제는 뒷면 (검은 면) 에 있습니다.
4. 얼음욕에 싱크대를 넣고 샌드위치 (검은색은 검은색을 향함) 를 넣고 전이완충액을 넣고 전극을 꽂고 100V, 1h (전류는 약 0.3A) 를 넣는다.
5. 막 전이가 완료되면 전원을 차단하고 혼합막을 꺼냅니다.
폐쇄와 교배
1. 25ml TBS 로 실온에서 5 분 동안 필름을 헹구고 흔들어주세요.
2. 실온에서 25ml 밀폐버퍼액 65438±0h 에 막을 놓고 흔들어줍니다.
3. 15mlTBS/T/t 총 3 회 (5min/T).
4. 적당히 희석된 일항제를 넣고 실온에서 부화 1-2h 또는 4 C 를 넣어 밤을 지새우며 천천히 흔들린다.
5. 1.5 밀리리터 TBS/t 총 3 회 (5min/T).
6. 적당히 희석된 알칼리성 인산효소 (AP) 또는 매운 뿌리 과산화물 효소 (HRP) 마크의 이항제를 넣고 실온에서 65438±0h 를 부화시켜 천천히 흔들어줍니다.
7. 1.5 밀리리터 TBS/t 총 3 회 (5min/T).
8. 1 5ml TBS 세탁1회. 다섯；오；5
착색
발광 액체 A 와 발광 액체 B 를 비례적으로 희석하여 섞는다. 이온수로 막을 약간 헹구고, 필터지를 모서리에 빨아들이고, A, B 혼합액으로 덮고, 불을 끄고 연한 녹색 형광대 (약 5 분) 까지 끈 다음, 필터지를 모서리에 빨아들여 랩에 고정시켜 신속하게 막을 덮고, 플라스틱 케이스를 닫고, 보이는 형광강도에 따라 노출한다.
필름을 제거하고 즉시 현상액 1 ~ 2 min 에 담그세요. 맑은 물로 깨끗이 헹구고 필름이 완전히 고정될 때까지 정영액에 넣는다. 맑은 물로 깨끗이 씻어서 말려라. 표시, 분석 및 스캔합니다.
WB 의 일반적인 문제와 해결책.
첫째, 신호 강도가 낮습니다
신호 강도가 낮다는 것은 정상 노출 조건에서 얻은 대상 밴드가 작거나 대상 밴드가 없는 것을 의미하며, 노출 시간을 늘리면 배경이 높고 잡대가 많은 등의 문제가 발생할 수 있습니다. 시약 품질과 조작 실수의 영향을 없애는 주된 원인은 다음과 같습니다.
① 샘플에는 단백질 표현이 부족하다. 고단백 표현의 세포주를 양성대조군으로 늘리거나, 더 높은 수준의 신호를 얻기 위해 샘플량을 적당히 늘리는 것이 좋습니다.
② 단백질 분해. 단백질 샘플 준비 과정에서 단백질 효소 억제제 PMSF 의 사용에 주의를 기울여 준비한 샘플을 가능한 한 빨리 검사하거나 잘 보존한다.
③ 단백질 전이. 고 분자량 단백질의 경우 적절한 조리개가 있는 막을 사용하고 막 이동 시간을 최적화하는 데 더 긴 막 이동 시간이 필요할 수 있습니다.
④ 항체 응용. 항체 반응의 종류와 실험 유형은 실험의 요구를 만족시킬 수 있다. 또한 항체 희석 비율과 부화 시간도 실험에서 수시로 최적화해야 한다.
⑤ 단백질과 항체 분리율이 낮다. 필름 세척 횟수를 줄이거나 필름 세척 시간을 줄이고, 필름 용액에서 NaCl 의 농도를 낮추는 등.
⑥ 항원은 폐쇄액으로 덮여있다. 다른 폐쇄액으로 전환하여 폐쇄액 중 단백질의 농도를 최적화하고 폐쇄시간을 단축한다.
⑦ 메탄올 농도가 너무 높다. 단백질은 SDS 에서 분리되어 젤에 침전되어 젤을 수축시키거나 단단하게 하여 고분자량 단백질의 이동을 억제한다. 실험에서 메탄올의 농도를 적당히 낮추거나 에탄올과 이소프로판올로 대체할 수 있다.
둘째, 비특이적 스트라이프 또는 스트라이프 위치가 잘못되었습니다.
WB 결과에서 과녁대 이외의 띠는 비특이성이라고 하는데, 비특이성 띠가 뚜렷하지만 과녁띠가 없으면 결과 분석에 큰 방해가 될 수 있습니다. 일반적으로 이러한 문제를 일으키는 주요 요인은 다음과 같습니다.
① 항체 비특이적 분리. 일반적으로 다중 복제 항체 특이성은 단일 복제 항체 보다 못하며 비특이적 스트라이프를 쉽게 생성할 수 있으며 항체 농도를 적절히 낮추면 잡대를 줄이는 데 도움이 됩니다. 동시에, 2 항비특이성 분리의 가능성을 배제하기 위해 2 항음성대조를 설정하는 것이 좋습니다.
② 샘플 단백질 함량이 너무 높습니다. 상형량을 적절히 줄이고 세탁시간과 폐쇄시간을 연장하면 높은 단백질 함량이 실험 결과에 미치는 악영향을 막을 수 있다.
③ 단백질 분해. 띠 위치의 변화로 인해 더 많은 잡대가 생기고 새로 준비한 샘플이나 동결 융해 횟수가 적은 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.
④ 세포 통과 횟수가 너무 많다. 단백질 표현의 분화를 초래할 수 있으며, 원시적이거나 세대가 적은 세포주를 사용하는 것이 좋습니다.
⑤ 단백질에는 복합물이 있다. 일부 대상 단백질은 다른 단백질과 분리되어 복합물을 형성하여 띠 위치를 변경합니다. 관련 문헌을 검토하여 단백질이 안정된 복합물을 형성할 수 있는지 확인해야 한다.
⑥ 단백질에는 스플 라이스 또는 다양한 변형이 있습니다. 부분 단백질에는 전단점이 있고, 일부 전단체는 면역활성을 가지며, WB 에서도 감지된다. 또한 일부 대상 단백질에는 당기화점 또는 기타 손질점이 있으며, 스트립 크기는 이론적 분자량을 훨씬 초과할 수 있습니다. 따라서 문헌이나 uniprot 에서 단백질 전단과 손질점의 크기를 확인해야 합니다.
셋째, 배경이 너무 높다
부분 WB 결과에서 밴드 바깥쪽이 비어 있어야 하는 배경도 어두운 색으로 나타나고, 분석 결과를 방해하며, 결과 그래프도 보기 좋지 않아 문장 발표에 사용하기가 어렵다. 이 문제의 가능한 원인은 다음과 같습니다.
① 봉쇄가 불충분하다. 배경이 높은 주요 원인 중 하나는 봉쇄에 문제가 있다는 것이다. 적절한 폐쇄제 (탈지 분유, BSA 등) 를 사용하는 것이 좋습니다. ) 반응 농도와 폐쇄시간을 최적화하는 동시에 항체 및 폐쇄제의 교차 반응 방지, 폐쇄제와 표적 항원, 내원성 바이오틴 또는 친화소/사슬 곰팡이 친화소의 호환성 금기에 주의를 기울여야 한다.
② 막 세척이 불충분하다. 적절히 세막 횟수를 늘리고 완충액 부피를 완화하고 트웨인의 20% 를 늘리면 세막이 불충분하여 발생하는 배경이 높은 문제를 개선할 수 있다.
③ 항체 응용 프로그램. 일항농도가 높은 것은 배경이 높은 원인 중 하나이며, 이항이 폐쇄제 비특이성과 분리될 수 있으므로 일항농도를 적절히 최적화하고 이항음성대조를 설정하는 것이 좋습니다.
④ 노출 시간이 길다. 실험에서 적절한 노출 시간을 사용하는 것이 좋습니다.
넷째, 막대 분산 또는 이상한 모양
경우에 따라 웹 결과 그래프에서 밴드의 위치가 예상과 일치하지만 밴드 분산, 모양 특이성 등의 요인으로 인해 사용할 수 없는 경우가 있습니다. 이 상황은 주로 다음과 같이 접착제나 전기 수영 과정에서 문제가 발생하는 경우가 많습니다.
① 전기 영동시 전압과 전류가 너무 높다. 이로 인해 스트라이프 마이그레이션 속도가 빨라지고 SDS-PAGE 온도가 높아져 스트라이프 분산 변형이 발생할 수 있습니다. 적절한 전기 영동 조건을 사용하여 저온을 유지하는 것이 좋습니다.
② 전극 불균형. 시조가 기울어져서, 적재할 때 샘플이 없는 플라스틱 구멍에 같은 양의 샘플 완충액을 넣으면 방지된다.
(3) 샘플의 양이 너무 높을 때 샘플의 소금 이온 농도가 높다. 샘플의 샘플 양이 너무 크면 스펙트럼 분산이 발생할 수 있고, 샘플 중 소금 이온 농도의 차이는 스펙트럼 균일하지 않은 등의 문제를 초래할 수 있다. 따라서 샘플량의 차이와 적합성을 보장하고, 동일하거나 낮은 소금 이온 농도를 고수해야 한다.
④ 플라스틱 문제. 접착제를 조절할 때는 반드시 골고루 섞어야 한다. 포장하기 전에 바늘로 고무구멍을 곧게 펴고, 고무구멍에 있는 거품을 불어낸다.
⑤ 전기 영동 완충액 보관 시간이 너무 길다. 전기 수영 실험에서 완충액 배치 시간이 너무 길면 결과에 악영향을 미칠 수 있으므로 제때에 완충액을 교체하는 것이 좋습니다.
다섯째, 필름의 얼룩이 고르지 않게 분포되어 있다
때때로 WB 가 결과를 낸 후 대상 밴드 외에 불규칙한 얼룩이 필름에 흩어져 있어 결과에 큰 방해가 될 수 있습니다. 이 문제의 주요 원인은 다음과 같습니다.
(1) 시약, 기기 등 오염. 각 실험 전후에 실험기기의 청산에 주의하여 문제가 있는 시약 교체를 제때 하는 것이 좋습니다.
(2) 필름을 돌릴 때 거품이 있다. 박막 이동 중 기포가 제거되었는지 확인하십시오.
③ 부화 중 항체 및 막 접촉이 충분하지 않다. 항체 부화 과정에서 액체의 총량이 충분한지 확인하고, 동시에 항체 분포를 고르게 하고, 흔들릴 때 부화를 멈춘다.
④ 노출 시간. 과다 노출은 반점을 더 뚜렷하게 만들 수 있으므로 적절한 노출 시간을 사용하는 것이 좋습니다.
⑤ 막은 지루하다. 실험에서 건조막이 나타나지 않도록 충분한 반응액이 있는지 확인해야 한다.