[키워드] 유전자 녹아웃; 배아 줄기 세포 뼈 보호제 골다공증
OPG 유전자 녹아웃 이형 접합체 모델을 만들 수 있을까요? 외부 ES 세포
조건? 오, 어 때? Nv, 닝광 등 아홉 번째 사람? 상하이 교통대학 부속 제 1 병원, 상하이 200232
[요약] 목적은 OPG 유전자를 두드리는 동원재조합 배아 줄기세포를 얻는 것이다. 방법 PCR 은 두 개의 동원암을 얻은 후 3.3kb Xbal/ BamHI 세그먼트를 짧은 팔로, 3.9kb NotI/ SalI 세그먼트를 긴 팔로 사용하여 OPG 외현자 2 와 작은 인트론 2 를 가리키는 타깃 캐리어를 만듭니다. 전기 천공을 통해 선형화 및 순화된 표적체 DNA 를 ES 세포로 전염시킨 후, 이 ES 세포계 중 일부는 G4 18 과 Gancyclovir 선택에서 생존한다. 둘? 마약? PCR 과 Southern 인장을 통해 항성 복제를 증폭하고 감정하다. 그 결과 총 124 개? 마약? 수확 저항성 복제, 그 중 하나가 양성으로 확인되었습니다. 결론적으로 본 실험 결과는 OPG 유전자 녹아웃 쥐 모델을 더욱 확립하고 체내에 깊이 들어가 OPG 를 연구하는 기초를 다졌다.
[키워드] 녹아웃; ES 세포 뼈 보호소 골다공증
골다공증은 골량 감소와 골미세 구조 파괴를 특징으로 하는 전신성 질병으로, 뼈의 취성이 증가하고 골절이 발생하기 쉬우며 인간의 건강에 영향을 미치는 흔한 병이다. 특정 동물 모델을 만드는 방법은 관련 분야 연구의 핫스팟이다. 골보호소, OPG) 는 최근 몇 년 동안 발견된 분비형 당 단백질 [1] 으로 파골세포의 분화와 흡수를 억제하는 활성을 가지고 있으며 종양 괴사인자 수용체 (TNFR) 초가계에 속한다. 연구에 따르면 OPG 는 골다공증, 류머티즘성 관절염, 페기트병, 악성 골조직 질환 (골육종, 거세포종, 전이암) 의 발병 메커니즘, 예방 및 치료에 중요한 역할을 한다. 본 연구는 분자 복제 방법을 이용하여 쥐 OPG 유전자 외현자 2 의 대부분과 인트론 2 의 일부 과녁 전달체를 설계하고 구축했으며, 유전자 타깃 기술을 통해 마우스 ES 세포의 OPG 유전자를 제거했다. 마이크로주사를 통해 OPG 유전자 녹아웃 마우스 모델을 더욱 만들기 위한 토대를 마련했다.
1 재료 및 방법
1. 1 실험 재료 운반체 플라스미드 pblue scriptⅰ(+/-) 및 XpPNT 플라스미드는 상하이 남부 모델 생물 센터에서 제공하고, PCR 제품 복제 운반체 pGEM? Teasy 는 Promega 의 제품이다. 각종 제한 내체효소, T4 DNA 연결효소, 무작위 유인물 DNA 표시 테스트 키트, 각종 Taq 효소, PCR 관련 시약, RT? PCR 은 Takara 와 NEB 에서 테스트 키트 구매했습니다. DNAmarker( 100bp 사다리, 1kb 사다리, Lamda-HindIII 단편) 는 NEB 와 Takara 에서 구매했습니다. 프로테아제 K 는 상해 공승생물공학기술서비스회사에서 구매한다. Trizol 은 GibcoBRL 과 Invitrogen 에서 구입했습니다. 작은 플라스미드 추출은 화순생물공학회사와 상해공승에서 테스트 키트 구매한다. 플라스미드 추출 테스트 키트 빠른 젤 추출 테스트 키트, Qiagen 에서 구입. Hyb 하이브리드 용액은 Clontech 에서 구입했습니다. 재래식 화학 시약 은 주로 적마 와 중국 의약그룹 상해 화학 시약 회사 에서 구매한다. 방사성 동위 원소 [α-32P]-dCTP 와 [α-32P]-dATP 는 Amersham 의 제품입니다. 세포 배양 관련 시약: DMEM 액체 배양기 포함 (고포도당, L? 글루타민, 피란산 나트륨 제외, ES? 세포? 자격), 비필수 아미노산, 글루타민, Ca2+/Mg2+ 가 없는 PBS, Ca2+/Mg2+ 가 포함된 PBS, β-메르 캅토 에탄올 (2- 메르 캅토 에탄올), 태소 혈청 (ES 세포? 합격), G4 18, 간 시클로웨이 (Gibco), 디메틸라폰 (DMSO), 페니실린/스트렙토 마이신, 트립신 (트립신 /EDTA), 콜라겐 (젤라틴) BRL, 적마 제품, LIF(ESGROTM) 는 CHEMICON (호주) 제품입니다. 35 mm, 100 mm 세포 배양 접시, 24 홀, 48 홀, 96 홀 세포 배양판, 원심관 등의 소모품은 모두 코닝 제품이다. 유인물 합성과 시퀀싱: 상하이 심요 생명기술회사가 완성한다. 시퀀스 데이터에 따라 DNAstar 패키지로 프라이머 시퀀스를 설계합니다. ES 세포계: 체외 도입 13 세대 마우스, CJ7 세포계 (Sv 129 마우스) 는 상하이 제 2 의과대학 기초의과대학 의학유전학과 보존된다.
1.2 실험 방법
1.2. 1 목표 캐리어 구축
1.2. 1. 1 게놈 DNA 수확 상태가 좋은 ES 세포를 추출하여 적당량의 분해액과 단백질 효소 K 를 넣고 56 C 에서 밤을 지냅니다. 다음날 샘플은 12000 rpm 의 실온에서 원심 분리10min; 。 청액을 모으고, 무수에탄올로 침전시키고, 얼음으로 예냉하고, 70% 에탄올로 세탁합니다. 공기 건조 후 적당량의 순수한 물을 용해시키고 4 ℃에서 예비품을 보존한다.
1.2. 1.2 PCR 방법을 통해 두 개의 상 동성 팔을 얻고 BLAST 를 통해 Genebank 에서 마우스 OPG 유전자 서열 얻기. NCBI GenBank 에서 제공하는 순서에 따라 DNAstar 소프트웨어의 Primerselect 를 사용하여 두 쌍의 유인물의 상류 및 하류 상동암을 결정합니다. 업스트림 동원암의 업스트림 유인물: CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT (OPG 유전자14842-14861BP 에 해당) 하류 유인물: tcgtctagaggaggctag aagacaca (OPG 유전자18152-18/kloc 에 해당) PCR 조건: 95℃, 5min；; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 94℃, 50s；; 60℃, 50s；; 72 C, 3.5 분 35 회 순환: 72 C, 65438 00 분; 4 C, 영원히. 상류 동원암 길이는 333 1 BP 입니다. 하류 동원암 상류 유인물: ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT (OPG 유전자 18580~ 18598bp 에 해당) 및 하류 유인물 ); PCR 반응 조건: 95℃, 5min；; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 94℃, 50s；; 6 1.5℃, 50s；; 72 C, 4 분. 35 사이클: 72℃, 65438 00 분; 4 C, 영원히. 하류 동원암 길이는 39 18 BP 입니다.
1.2. 1.3 DNA 조각을 XpPNT 벡터에 올바르게 복제합니다. 두 개의 동원암의 PCR 산물을 회수하여 PCR 산물 복제 전달체 pGEM 에 연결합니까? 대장균 형질 전환 증폭 후 검출, 시퀀싱 및 동정. 일반적인 방법으로 NotI/SalI 를 사용하여 다운스트림 동원암을 벡터 X 로 가져옵니다. PpnT, 그리고 상류 동원암을 X 에 삽입할까요? PpnT 전달체는 제한적인 내체 효소 감정 및 서열 측정을 통해 순서가 정확하다는 것을 보여준다. 표적 벡터를 5-3opg-XpPNT 로 명명하고, NotI 제한 내체효소로 선형화하고, 회수하여-20 C 의 예비에 보존한다.
1.2.2 ES 세포의 유전자 과녁
1Ca2+.2. 1 ES 세포의 전기 천공 유전자 전이는 0.8 ml 밀도가 약 1.2× 107/ml 인 ES 단세포 현액을 채취한다. XpPNT), 혼합 및 무균 전기 천공 컵으로 이동. 실온에서 240 V 와 500 μF 의 전기 매개변수로 단일 펄스 충격을 한 후 세포를 ES 배양기에 다시 매달아 세포 현액을 두 개의 35 mm 콜라겐화 플레이트에 골고루 접종한다. 비선택적 배양기에서 24 시간 회복한 후 약을 선별하다.
1.2.2.2 약물이 항성세포를 선별하는 약물 선택은 전기천공 유전자 전이 후 24 시간 만에 시작된다. 그 중 1 30mm 플레이트는 선택적 약물 G4 18 (최종 농도 400 g/ml) 및 간 시클로 비르 (최종 농도 2 mmol/L) 가 포함된 선택적 배양기에서 배양되고, 기타/KLOC 7~8 일간의 선별을 거쳐 ES 세포 복제는 육안으로 볼 수 있는 세포 집락으로 자라서 따낼 수 있다. 14 일 * * * * 약 124 개의 내약 세포 복제 선별.